litceymos.ru 1

Практична робота

Дослідження ферментоутворюючої функції шлунка

Поряд з визначенням кислотоутворюючої функції шлунка не менш важливе значення має і визначення функціональної активності головних клітин. Існує багато методів визначення протеолітичних ферментів шлункового соку, в основу яких'покладена здатність шлункових ферментів гідролізувати білки. По залишку негідролізованого субстрату або по кількості продуктів гідролізу визначається протеолітична активність соку. Недооцінка і зневажливе ставлення до показників ферментоутворюючої функції знижує діагностичну цінність зондового методу.

Найбільш точним методом визначення протеолітичної активності пепсину в шлунковому соці є колориметричний з використанням калібровочних графіків, побудованих за розчинами кристалічного пепсину з відомою концентрацією і активністю (В.А. Арабаджан,1973; Р.І. Блохіна,1977 т.і.). Однак, стандартні зразки пепсину не завжди доступні, що стримує впровадження сучасних методів визначення пепсину в лабораторну практику.

Нами розроблена методика визначення пепсину в шлунковому соці з використанням як еталону стандартних розчинів амінокислот тирозину і триптофану. Вміст пепсину в шлунковому соці визначається по кількості тирозину і триптофану, які утворюються в результаті гідролізу субстрату. Відповідно і калібровочний графік будується по тирозину і триптофану . Для проведення дослідження необхідно:


Матеріали :

термостат, фотоелектроколориметр, хроматографічний папір марки "М", або фільтри обеззолені з синьою стрічкою, пробірки, воронки.


Препарати:

Хлористоводнева кислота 0,3 н і 0,2 н , трихлороцтова кислота 5% (ТХО) , NaOH 0,1 н і 0,5 н , 2% розчин ліофілізованого бичачого гемоглобіну, марки " Б", або сухої плазми крові людини групи А - II або В - III, L - тирозин, D -триптофан (чисті хромотографічно).

Субстрат готують у день визначення шляхом розчинення у воді, а потім 0,3 н хлористоводневою кислотою потенціметрично встановлюють рН - 1,8 .


10

Побудова калібровочного графіка: 25 мг L - тирозину і 25 мг L - триптофану розчиняється в 10 мл 0,1 н розчину NaOH і доливається до 25 мл дистильованою водою. Таким чином отримується основний розчин, який містить 2 мг суміші вказаних амінокислот . Із основного розчину, шляхом його розведення дистильованою водою в 20 разів, готують робочий розчин (100 мкг/мл). Для того, щоб концентрація вказаних амінокислот в пробах відповідала : 10; ЗО; 50; 70; 120; 200 мг в 2,5 мл розчину, необхідно попередньо розлити в пробірки дистильовану воду в кількості 2,4; 2,2; 2,0; 1,8; 1.5; 1,3; 1,0; 0,8; 0,7; 0,6; 0,5 мл. Потім в ці пробірки необхідно додати 0,1; 0,3; 0,5 мл і т.д. робочого розчину суміші амінокислот до общему 2,5 мл. До проб додають по 2 мл 0,5 н розчину NaOH, 1,5 мл розчину Фоліна, розведеного 1:2. Інтенсивність забарвлення вимірюють через 10 хвилин проти води на фотоелектроколориметрі на червоному світлофільтрі з максимумом поглинання 630 нм в кюветі з робочою довжиною 5 мм.

Співставлення калібровочних графіків, побудованих з використанням суміші амінокислот і кристалічного пепсину, дозволило визначити коефіцієнт перехунку (К) з калібровочного графіка , побудованого на суміші амінокислот на калібровочний графік побудований на розчині пепсину. Таким чином, коефіцієнт дозволяє обчислити кількість пепсину в шлунковому вмісті. Якщо використовується гемоглобіновий субстрат, то К = 0,0669, а якщо суха плазма крові, К-0,1355.

Хід визначення: Шлунковий сік в залежності від рН і застосування стимулятора шлункових залоз, розводиться 0,02 н соляною кислотою в 10-20 або 40 разів. В дослідні і дві контрольні пробірки вносять по 1 мм 2% розчину субстрату і термостатують на протязі 5 хвилин на водяній бані при температурі 37 С. Після цього в дослідні пробірки ( з інтервалом ЗО сек) доливають по 0,2 мл досліджуваного шлункового соку, а в контрольні по 0,2 мл дистильованої води. Проби інкубуються 10 хвилин при тій же температурі. Після цього з ЗО сек інтервалом додають по 5 мл 5% розчину ТХО в кожну пробірку. Потім, через 5 хвилин, вміст пробірок фільтрують через щільний хроматографічний папір марки "М" або фільтри обеззолені з синьою стрічкою. До пробірки з 5,0 м л розчину NaOH додають по 2,5 мл фільтрату дослідних і контрольних пробірок і 1,5 мл реактиву Фоліна. Інтенсивність забарвлення вимчрюють через 10 хвилин проти води на фотоелектроколориметрі при червоному світлофільтрі з максимумом поглинання 670 нм в кюветах з робочою довжиною 5 мм.


Розрахунок проводять за формулою:

А х К х 5 х В

1000 = мг/мл де

11

A - мкг амінокислот в пробі, обчислені по калібровочному графіку по оптичній щільності ( Е досліду - Е контролю).

К -коефіцієнт перерахунку для гемоглобіну = 0,6669, для сухої плазми крові = 0,1355.

5 - фактор перерахунку з 0,2 мл соку на 1 мл.

В - розведення соку.

1000 - фактор перерахунку з мкг на мг.

Приклад: Отриманий шлунковий сік розбавляємо в 10 разів. Для цього беремо 0,2 мл соку і доливаємо до нього 1,8 мл 0,02 н розчину соляної кислоти. І далі робимо так, як описано в розділі "Хід визначення". При проведенні реакції з субстратом гемоглобіном екстинція проби склала 0,102. По калібровочному графіку це відповідає 41,5 мкг тирозину і триптофану. Для обчислення кількості пепсину в пробі шлункового соку необхідно 41,5 помножити на коефіцієнт перерахунку 0,0669. Таким чином, отримуємо число, що відповідає кількості пепсину в 0,2 мл шлункового соку, тобто це буде 2,77 мкг. По відомій формулі вираховуємо концентрацію пепсину в мг/мл.

2,77x5x10 1000 =0,139 мг/мл

І далі визначаємо дебіт пепсину за об'ємом шлункового соку за 15, ЗО і 60 хвилин, якщо це потрібно.

Практична робота

Дослідження слизоутворюючої функції шлунка

Не менш важливим компонентом шлункового соку є слиз, шо виділяється клітинами поверхнього епітелію слизової оболонки шлунка, який можна охарактеризувати шляхом сумарного визначення глікопротеїнів (глікозилірованих білків або диференціювати глікозамінглікани (аміноцукри) або фукоглікопротеїни, що входять до їх складу.

В лабораторії розроблена і апробована модифікація відомого методу Ledvina (1968) визначення глікопротеїнів шлункового соку (гастромукопротеїну).

Для проведення дослідження необхідно:

Матеріали :

фотоелектроколориметр, термостат, центрифуга на 10000 об/хв, обеззолені фільтри з синьою стрічкою, пробірки, воронки.

Препарати :

сульфосаліцилова кислота 20%, фосфоровольфрамова кислота 5% в 2н розчині хлористоводневощї кислоти: NaOH 0,1н і 10% розчини; реактив Фоліна, розведений дистильованою водою 1:3 ; L- тирозин чистий хроматографічний або з набору амінокислот.

Побудова калібровочного графіку: ЮОмг тирозину розчиняють в 200 мл 0,1н NaOH - це основний розчин, що містить 500 мкг/мл. Потім з основного розчину готують робочий розчин ( 5 мл основного розчину доводять до 100 мл 0,1н NaOH). З робочого розчину готують стандартні проби з вмістом тирозину 1,25; 2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 12,5; 15,5; 15,0; 17,5; 20,0; 22,5; 25,0 мкг в 2 мл 0,1н NaOH. Кольорову реакцію проводять з додаванням 0,5 мл реактиву Фоліна і 1,3 мл 10% розчину NaOH. цнтенсивність забарвлення вимірюють через 10 хвилин в кюветах з робочою довжиною 10 мм, при 630 нм. Контролем служить розчин,що складається з 2 мл 0,1н NaOH, 0,5 мл реактиву Фоліна і 1,3 мл 10% розчину NaOH.


Хід визначення : попередньо профільтрований шлунковий сік в залежності від використовуваного подразника шлункової секреції розбавляють в 2 - 5 разів дистильованою водою. Потім 0,5 мл розведеного соку поміщують в пробірки з 5мл дистильованої води і додають 2 мл 20%-ої сульфосаліцилової кислоти. Через 10 хвилин отриманий розчин фільтрують, 5 мл фільтрату вміщують у центрофужні пробірки і змішують з 1 мл фосфоровольфрамової кислоти. Через 15 хвилин залишок центрофугують (1000 об/хв, на протязі ЗО хвилин), прозорий супернатант зливають. Пробірки з осадом перекидають вгору дном і висушують на фільтрувальному папері. Осад розчиняють в 2 мл 0,1н NaOH, додають 1,3 мл 10% NaOH, потім 0,5 мл реактиву Фоліна і через 10 хвилин фотометрують.

Розрахунок проводять за формулою:

А. 2. В 1000 =мг/мл

де А - мкг тирозину, обчислені по калібровочному графіку по оптичній щільності,


2 - фактор перерахунку з 0,5 мл соку на 1 мл,

В - розведення соку,

1000 - фактор прерахунку з мкг на мг.

Практична робота

Визначення жовчних кислот в шлунковому соці

Вміст жовчі в шлунковому соці можна оцінювати по концентрації і дебіту холевоі кислоти. Визначення жовчних кислот проводилось за методом Рейнхолда і Вілсона.


Матеріали:

фотоелектроколориметр, центрифуга, пробірки.термостат, гумові пробки,

Препарати:

фурфурол, сірчана кислота, холева кислота, їдкий натрій. Реактиви готують в день визначення:


  1. Свіжоприготований 0,9% розчин фурфуролу. Для цього до 0,9% розчину
    фурфуролу доливають 99,1 води і сколочують до одержання однорідної
    рідини.

  2. 16 н розчин сірчаної кислоти: 447 мл концентрованої сірчаної кислоти ( d
    = 1,835, витримує пробу Саваля) повільно і обережно вливають в 553 мл
    дистильованої води.

  3. Стандартний розчин холевої кислоти: 0,100г холевої кислоти вносять у
    вимірну колбу об'ємом 50 мл, розчиняють у 3 мл 0,1н розчину їдкого натру і
    доводять об"єм розчину водою до відмітки (Імл розчину містить 2 мг холевої
    кислоти).

Практична робота

Побудова калібровочного графіка

Для побудови калібровочного графіка готуємо стандартний розчин холевої кислоти: 10 мг холевої кислоти розчиняємо у 0,5 мл ОДн NaOH і доводимо до 10 мл дистильованою водою. Потім готуємо ряд розведень:



N

станд.

Н2О

Вміст холевої

п/п


розчин,м




кислоти в




л




пробі,мг

1. ,

0,05

0,95

0,05

2. '

,А!^_

_g,9i

0,1

3.

1 оЗ

0,5

0,5

4.

L__LO__J

-

1,0

Хід визначення

До 1 мл шлункового соку (розведеного дистильованою водою в залежності від його забарвлення 1:10; 1:25; 1:50) додають 1 мл 95 етилового спирту.

Вміст пробірки змішують і осад відділяють центрифугуванням при 3000 об/хв на протязі 15 хвилин. До 1 мл супернатанту доливають Імл свіжоприготованого 0,9% розчину фурфуролу і 6 мл 16н сірчаної кислоти, старанно перемішують, нещільно закривають гумовою пробкою і зразу ж ставлять на водяну баню при температурі 70 С на вісім хвилин. Потім пробірки охолоджують на протязі 2-х хвилин у проточній воді і визначають величину оптичноі щільності на фотоелектроколориметрі в кюветах з товщиною шару 0,5 см при довжині хвилі 630 нм (червоний світлофільтр). Розчином порівняння служить 16н розчин сірчаної кислоти.


Разрахунок концентрації холевої кислоти в шлунковому соці проводиться за формулою:

А * 2 * В * К = ммоль/л

де А - мг/мл холевої кислоти в пробі, вирахувані по калібровочному графіку. 2 - розведення соку етиловим спиртом. В - розведення соку дистильованою водою. К - коефіцієнт перерахунку з мг/мл на ммоль/л, який дорівнює 2,55

З метою підвищення точності оцінки функціонального стану секреторних залоз шлунка в сучасній гастроентерології велике значення надається коефіцієнту агресивності шлункового соку, який вираховується із співвідношення агресивних факторів до факторів захисту і визначається по такій формулі:



К -

А + В +С

D

де в чисельнику

А - дебіт пепсину (мг/год),

В - Н + (ммоль/л.ч),

С - дебіт жовчних кислот (ммоль/л)

в знаменнику

D - дебіт гастромукопротеїдів ( мг/год)

Таким чином, визначення протеолітичної активності шлункового соку, темпу секреції Н-іонів, вміст жовчних кислот і гастромукопротеїдів ще не

15

може бути надійним критерієм оцінки функціонального стану секреторних залоз шлунка, в той час, як вирахування коефіцієнта агресивності шлункового соку в значній мірі сприяє виявленню активних і неактивних фаз перебігу патологічного процесу у конкретного обстежуваного.

Література.

І.Арабаджли В.Н. К методике определения пепсина в желудочном соке//Вопр. практич. гастроэнтерологии.-М., 1978.-С.75-76.

2. Блохина Р.И., Зекцер Э.С., Тротенькова Т.Т., Шатерников В.А., Количественное определение пепсина в лекарственных препаратах// Фармация,1977.-Ш.-С.61-62.

  1. Гаршин К.А. Изучение желудочной секреции путем определения темпа
    секреции водорлодных ионов//Лаб. дело.-1972.-N10.-С.579-581.

  2. Лея Ю.Я. рН -метрия желудка.-Л.: Медицина, 1987.-144с.

5.Кау A.W. Effect of large doses of histamine of gastric secretion of HCL ( An augmented histamine test)// Brit.Med.J.,1953.-vol.48.-N2.-p.77-80.