litceymos.ru 1


Лабораторна робота 6

Моделювання нейронних систем


Мета: ознайомитися із програмою, яка забезпечує широкі можливості для моделювання різноманітних процесів на окремому нейроні.

Прилади та матеріали: комп’ютер з програмним забезпеченням, папір для друку результатів дослідження.


Хід роботи

Частина 1


Потенціал-залежні струми

А-струм


Моделі в цієї частини програми застосовує кінетичні параметри, опубліковані Byrne (1980 a,b), взяті з нервової системи мушель, тому струми є дещо повільнішими порівняно з нервовими системами хребетних, але загальні принципи такі самі.

1. Завантажити файл А-1. Мається стандартний препарат: нейрон із двома вживленими електродами. Зліва на екрані – рамка із заголовком Active Channels. У ній показано, що нейрон містить три типи потенціал-чутливих каналів: швидкі натрієві канали, повільні випрямні й швидкі калієві канали. Перші два є звичайним повільним варіантом стандартних каналів Ходжкіна-Хакслі. У даний момент цікавий саме третій тип – швидкі калієві канали, або А-канали.

2. Запустити модель, натиснувши кнопку Start. Коли початкові розрахунки будуть закінчені, на екрані з’являться графіки. На графіку провідності натрієвий канал зображений коричневим, звичайний калієвий – зеленим, швидкий калієвий – блакитним кольорами. Перша провідність, яка починає зростати, – це швидка калієва. Тому цей струм і називається швидкий калієвий струм – у результаті стимуляції він активується раніше, ніж звичайний натрієвий. Проаналізувавши графіки струму, можна побачити, що А-струм (струм, що проходить через швидкі калієві канали) починає зростати, коли нейрон деполяризується.

3. Роздрукувати графіки і вклеїти результати.

Треба зауважити, що рання активація А-струму зменшує рівень деполяризації нейрона у відповідь на стимуляцію. Звичайно нейрон досягає рівня для нормального натрієвого потенціалу дії (ПД), і тоді виникають звичайні Na- і К-струми, але раніше у відповідь на стимуляцію з’являється А-струм, який домінує у відповіді й визначає її тривалість.


4. Очистити екран і перейти до Setup View. Ознайомитись із рамкою Brocking Drugs
. Однією з речовин є 4-АР - 4-амінопіридин, специфічний блокатор швидких К-каналів. Застосувати цю речовину, натиснувши на її позначення, і провести експеримент знову.

5. Отримані результати роздрукувати, вклеїти в зошит і пояснити.

6. Очистити екран, повернутися до Setup View і відмінити 4-АР. Змінити спосіб стимуляції на Voltage clamp і провести експеримент. Звичайні Na- і К-струми вже відомі, тому необхідно подивитись на властивості А-струму. Він починається швидко і швидко зростає, але потім інактивується. Ця інактивація – одна з ключових функцій для А-струму. А-струм затримує ПД нейронів у відповідь на стимуляцію у зв’язку з тим, що рано активується, але не може попередити їх ПД, якщо стимуляція продовжується, тому що звичайно інактивується. Коли А-струм повністю інактивований, нейрон може реагувати, наче на нього струмом і не діяли.

Нейрони, які ендогенно розряджаються

Деякі нейрони продукують спонтанну активність, навіть коли вони повністю ізольовані від синаптичних входів. Нейрони, які продукують регулярну спайкову активність, називаються ендогенними пейсмекеровими нейронами. У цих нейронах баланс іонних струмів внутрішньоклітинний навіть при гіперполяризованому мембранному потенціалі, таким чином, вони наче постійно деполяризуються зовнішніми деполяризуючими стимулами й продукують повторні спайки з відносно постійною частотою. Такі нейрони називаються нейронами, що ендогенно розряджаються. Два типи спонтанно активних нейронів мають деякі спільні ознаки, і цікаво те, що нейромодулятори можуть іноді перетворювати один тип нейронів на інший. У цій моделі треба спробувати розібратись, як функціонують нейрони, які ендогенно розряджаються, і дослідити деякі засоби, за допомогою яких ці властивості можуть бути модульовані.

1. Завантажити файл burst-1 і подивитися на рамку Active Channels
у Setup View. Зображені стандартні НН канали (швидкий Na і повільний випрямний К), але є ще два додаткові.


Повільний Са – канал – низькопороговий потенціал-залежний канал із повільною сталою часу. Факт, що канал має низький поріг, означає, що він має ненульову провідність навіть при досить гіперполяризованому МПС, тому існує внутрішньоспрямований Са-струм, який намагається деполяризувати нейрон. Коли нейрон деполяризується, кальцієва провідність зростає, тому що вона потенціал-залежною, і вхід Са також зростає. Проте зростання провідності досить повільне, тому інші канали відкриваються до того, як повільний кальцієвий спайк може розвинутись.

Ці канали схожі на Na-канали, за винятком того, що вони не потребують стимуляції для активації і не інактивуються. (Деякі Са-канали цього типу дійсно можуть інактивуватись – чи у відповідь на деполяризацію, чи у відповідь на підвищення внутрішньоклітинної концентрації Са, але наша модель досить проста.) Струм, опосередкований цим типом кальцієвого каналу, часто називають В-струмом.

Кальцій – залежний калієвий канал одночасно і потенціал-залежний, і залежний від внутрішньоклітинної концентрації Са. Це означає, що для того щоб цей канал був відкритий, нейрон має бути деполяризований і мати відносно високу концентрацію вільного внутрішньоклітинного Са. Струм, опосередкований кальцій-залежними калієвими каналами, часто називають С-струмом.

Треба мати на увазі, що точні властивості цих В- і С-каналів не базуються на особливих експериментальних даних, проте мають приблизно правильні властивості.

2. Запустити експеримент і прослідкувати за розрядами спайків нейрона без будь-якого зовнішнього впливу. Графіки провідності й струму показані для В- і С-каналів, тому що вони важливі для розуміння механізму. Звернути увагу на ту частину графіка, де нейрон досягає найбільш гіперполяризованого стану за цикл. У цій фазі віртуально немає вихідного С-струму (червоний колір), але є вихідний В-струм (блакитний колір). Вхідний струм деполяризує нейрон, при цьому потенціал дедалі крутіше наростає, аж поки нейрон не починає генерувати спайки. Ця деполяризація значно підвищує В-провідність і струм, унаслідок чого зростає внутрішньоклітинна концентрація Са. Деполяризований “горбик” під пачкою спайків, з’єднуючись із підвищеною концентрацією Са, підвищує С-провідність, що зумовлює підвищення вихідного С-струму. Цей струм звичайно перевищує В-струм і нейрон гіперполяризується, зупиняючи розряд спайків. Коли нейрон гіперполяризований, В-провідність зменшується і потік Са всередину також зменшується. Це дозволяє внутрішньоклітинному механізму викачати вільний Са, що, в свою чергу, зумовлює зниження С-провідності. С-струм знижується до рівня, коли залишковий В-струм перевищує його, і нейрон починає знову деполяризуватись. І, таким чином, увесь цикл повторюється нескінченно.


3. Роздрукувати графік і записати пояснення.


Блокатори

1. Простежити внесок різних каналів, застосовуючи різні блокатори. Спочатку – кадмій (Cd2+). Це сильна отрута – важкий метал, який блокує Са-канали. Запустити експеримент.

2. Результати роздрукувати графіки, описати й пояснити його.

3. Забрати кадмій (і будь-яку стимуляцію) і застосувати апамін. Апамін – речовина, яку отримують із бджолиного яду, вона блокує Са-залежні К-канали в деяких нервових системах.

4. Запустити експеримент, роздрукувати графіки, описати й пояснити результати.

5. Забрати апамін і застосувати тетродотоксин (ТТХ), який блокує Na-канали.

6. Запустити експеримент, роздрукувати графіки, описати й пояснити результати.

Потенціали плато


Деяким нейронам притаманне те, що називається властивостями плато. Це означає, що нейрон не ендогенно активний, тому в разі відсутності будь-якої стимуляції він не реагує. Проте, якщо виникають збуджуючі стимули, такі, як імпульс струму або синаптичний вхід, нейрон продукує довготривалу відповідь, більшу за тривалістю, ніж стимул. Навпаки, якщо виникає гальмуючий вплив під час відповіді, то відповідь припиняється. Між нейронами є тісні функціональні взаємозв’язки, тому деякі системи нейронів можуть перетворюватись із одного з цих типів на інший, змінюючи баланс певних нейромодуляторів.

1. Перезавантажити файл burst-1, повернувшись до стандартних умов для нейронів з ендогенними розрядами. Вибрати активний канал, позначений Са slow fo mollusc (№ 3), потім вибрати кнопку Props. З’явиться велике меню діалогу, але його майже повністю можна ігнорувати.

2. Вибрати параметр V (mid) у колонці Activation, яка знаходиться приблизно посередині меню. Там має бути значення – 35. Треба змінити його на – 32. Цей параметр установлює мембранний потенціал, при якому канал має половину максимальної провідності.


Зміна значення з 35 на 32 робить канал менш активним при всіх рівнях потенціалу. Щоб отримати той самий рівень активації, як і раніше, нейрон має бути на 3 мВ більш деполяризований.

3. Параметр, позначений Мах соnd, змінити з 0,5 на 0,6.

4. Запустити експеримент, звернути увагу, що нейрон не реагує. В-провідність недостатньо активована при МПС, щоб деполяризувати нейрон.

5. Установити амплітуду стимулу в Setup View 1 нА, тривалість 50 мс, затримку 1000 мс. Запустити експеримент і зазначити, наскільки відповідь нейрона триває довше за стимул (можете заміряти її).

6. Установити амплітуду другого стимулу – 1нА з тривалістю 50 мс і затримкою 1300 мс. Гальмуючий стимул припиняє впливати.

7. Установити перший стимул на 0 та підвищити тривалість другого, негативного стимулу (приблизно 500 мс). Запустити експеримент, прослідкувати за плато. Письмово пояснити його виникнення, роздрукувати результати.

Розряди, викликані іншими механізми


Більшість учених погоджується, що вся чи майже вся розрядна активність пов’язана з коливанням провідності мембрани та залежить від кальцію. Одним із загальних механізмів є самопригнічення повільного кальцієвого струму (В-струм). Він може або інактивуватись безпосередньо у відповідь на зміну потенціалу, або бути пригніченим підвищеною внутрішньоклітинною концентрацією кальцію, як дзеркальний ефект до кальцій-активованих калієвих каналів.

1. Завантажити й запустити файл burst-2. Ряд спайкових розрядів дуже схожий на той, що ви бачили у кальцій-залежних калієвих каналах. Застосувати апамін. Спайкові властивості зміняться, але нейрон досі продукує спайки. Це пов’язано з тим, що кальцієві канали в цій моделі інактиваційні. Це можна дослідити, застосувавши метод фіксації потенціалу. Застосувати коротке замикання.

2. Застосувати апамін, ТТХ і ТЕА і запустити експеримент. Простежити який єдиний активний канал лишається незаблокованим.


3. Роздрукувати графік і пояснити результати.


Частина 2

Постсинаптичні потенціали




Фізіологія збуджуючого постсинаптичного потенціалу (ЗПСП)


1. Завантажити файл Ach-1. Необхідно звернути увагу, що в Setup View немає активних каналів; це повністю пасивний нейрон. Проте він отримує синаптичний вхід. У ванночці є пресинаптична терміналь, яка підходить до нейрона. Щоб краще її роздивитись, треба переключитися в Synapse View, вибравши команду Synapses у Window menu, або Synapse View в опції toolbar.

Організація програми: Setup View контролює стимули, спосіб реєстрації і блокатори, які можна застосувати. Synapse View контролює часові характеристики синаптичного входу та властивості самих синапсів. Result View показує результати.

Зліва на екрані в Synapse View є рисунок, на якому синапс типу А контактує з нейроном, а справа – текст, де вказано, що синапс типу А є нікотиновим ацетилхоліновим синапсом і що він активний.

2. Натиснути кнопку Start. На Result View будуть зображені мембранний потенціал, синаптичний струм і синаптична провідність. У цьому прикладі синаптична провідність є нереальною, оскільки має криву на графіку квадратної форми, а струм – ні. Він стрімко зростає (чи, правильніше, будучи внутрішньоспрямованим, стрімко падає), але поступово знижується протягом періоду, тоді як провідність залишається незмінною. Коли провідність відключити, струм різко падає до нуля. Струм знижується протягом середнього періоду, тому що, коли мембрана деполяризована, потенціал наближається до рівноважного потенціалу тих іонів, які проникають через мембрану. У зв’язку з цим, хоч провідність для цих іонів залишається постійною протягом періоду синаптичної активації, рушійна сила зменшується, і тому зменшується струм.

Можна зробити форму кривої на графіку більш реальною.


3. Перемкнути на Synapse View і натиснути кнопку Props для синапсів типу А. У опції Main Synaptic Properties замінити Square waveform на Alpha waveform. Потім натиснути OK і перезапустити експеримент. Зверніть увагу, що графік провідності має більш згладжений вигляд з відносно швидкою фазою наростання й повільнішою спаду.

4. Повернутися до Setup View і встановити амплітуду першого стимулу 0,2 нА, запустити експеримент. Синаптичний вхід тепер накладається на імпульс деполяризуючого струму. Необхідно звернути увагу, що відносна амплітуда ЗПСП знижена і, хоча синаптична провідність не змінена, синаптичний струм знижений, так як і потенціал.

5. Не очищаючи екран, повернутися до Setup View і встановити амплітуду стимулу – 0,2 нА. Знову запустити експеримент. Відносна амплітуда і струм, але не провідність ЗПСП, підвищаться.

6. Роздрукувати графік, зробити письмові висновки і пояснення.

7. Повернутися до Setup View, вимкнути струм і зменшити концентрацію кальцію. Запустити експеримент.

8. Роздрукувати графіки, пояснити їх і зробити висновки.


Частина 3

Сумація і полегшення




Часова сумація


1. Очистити Result View, якщо необхідно, переключитися на Synapse View, встановити латентність 10 мс, вибрати опцію repetitive, встановити інтервал 5 мс.

2. Запустити експеримент. Високочастотна (200 Гц) пачка ЗПСП з’явиться на екрані. Необхідно звернути увагу, що провідність не змінюється впродовж усієї пачки стимулів, тоді як амплітуда потенціалу відображає часову сумацію. Часова сумація має місце, коли фаза зниження потенціалу одного ЗПСП не знижується остаточно до вихідного рівня перед появою наступного ЗПСП.

3. Роздрукувати графік і зробити письмові висновки.


Просторова сумація

1. Очистити Result View і завантажити файл Ach-2. Звернути увагу, що в Synapse View два синаптичні входи активні. Обидва вони нікотинового ацетилхолінового типу, але просторово відокремлені; іншими словами, походять від різних пресинаптичних закінчень і тому з’являються у анатомічно різних місцях постсинаптичної мембрани. З’являються вони із різною латентністю. Запустити експеримент і простежити за виникненням двох ЗПСП; вони не сумуються, тому що виникають у різний проміжок часу. Треба зазначити також відмінність струму. У попередньому експерименті реєструвався синаптичний струм, у даному випадку – загальний струм через мембрану.


2. Збільшити латентність синапсу Е до 25 мс і запустити експеримент. Простежити і за часовою, і просторовою сумацією.

3. Установити однакові латентності для обох ЗПСП. Запустити експеримент.

4. Роздрукувати графік і зробити висновки.


Полегшення

1. Завантажити і запустити файл Ach-3. На екрані з’явиться пачка ЗПСП із відносно низькою частотою (20 Гц), при цьому сумація не відбувається. Кожен ЗПСП повертається до рівня МПС доти, поки почне розвиватись новий ЗПСП. Проте відбувається прогресивне зростання амплітуди, тому що при повторній активності зростає провідність. Цей процес називається полегшенням і є результатом збільшення кількості медіатору, який вивільняється в ході повторної активації пресинаптичної мембрани.

2. Очистити екран, зменшити інтервал між ЗПСП (у Synapse View) до 25 мс.

3. Роздрукувати результати досліду і зробити висновок.

4. Завантажити і запустити файл Ach-4, простежити за феноменом антиполегшення, або згасання при якому кількість медіатору, який вивільняється пресинаптичним закінченням, зменшується в разі повторної активації. Антиполегшення іноді називають синаптичною втомою, на наш погляд, це не дуже вдалий термін, значення якого має елемент невідворотності ефекту. У той час, як (віртуально) усі хімічні синапси втомлюються (вичерпують весь свій медіаторний запас), наприклад, у разі тривалої високочастотної стимуляції, синапси з антиполегшенням проявляють спеціальну відповідь, при якій вони згасають навіть при досить помірній частоті активації. Вважається, що антиполегшення лежить в основі багатьох форм поведінкового звикання, яке є простою формою навчання.

5. Роздрукувати результати досліду і зробити висновок.


Гальмування

1. Завантажити файл Inhib-1. Звернути увагу, що в Synapse View є два активні синапси, тип Bгліцинергічний синапс, тоді як тип СГАМКергічний синапс.


2. Запустити експеримент. На кривій, яка відображає зміну потенціалу, помітна невелика гіперполяризація у відповідь на дію гліцинергічного синапсу і невеликий деполяризаційний потенціал у відповідь на дію ГАМКергічного синапсу. Можна було б інтерпретувати ці події, як розвиток гальмівного постсинаптичного потенціалу (ГПСП) за яким виникає ЗПСП.

3. Переключитися тепер до Setup View і встановити амплітуду струму першого імпульсу на 0,5 нА. Запустити знову експеримент і звернути увагу, що обидва ПСП тепер негативні. Більше того, в той час як амплітуда струму першого ПСП зростає (паралельно зростає потенціал), струм другого ПСП змінює свою полярність. Пояснити цей процес.

4. Установити імпульс струму на – 0,5 нА і простежити, як зміниться потенціал і струм першого синапсу. Провести серію експериментів з метою знайти рівноважний потенціал для обох синапсів. Визначити які іони можуть переносити струм.

5. Роздрукувати графік і зробити висновки.


Синаптична взаємодія

1. Завантажити й запустити файл Inter-1. Після ГПСП з’являється ЗПСП. Переключитися на Sinapse View, не очищаючи екран, і встановити для обох активних синапсів однакову латентність 30 мс.

2. Перезапустити експеримент. ГПСП тепер сумується із ЗПСП таким чином, що амплітуда ЗПСП знижена.

3. Змінити латентність ГПСП так, щоб він не збігався повністю із ЗПСП. Наприклад, 28 і 32 мс і простежте за формою кривої сумарного потенціалу.

4. Роздрукувати графік і вклеїти результати в зошит. Зробити висновки.

5. ГПСП можуть бути досить складними для розуміння, особливо деполяризаційні. Завантажити й запустити файл Inter-2. Зміна потенціалу має вигляд слабкого ЗПСП, після якого з’являється сильний ЗПСП, але графіки провідності свідчать, що перший ПСП пов’язаний із набагато сильнішою зміною провідності, ніж другий. Проте перший ПСП має рівноважний потенціал, близький до потенціалу спокою на мембрані, тому зміна потенціалу в разі його активації незначна.


6. Установити латентності для обох синапсів на 30 мс, щоб обидва потенціали збігалися. Запустити експеримент.

7. Роздрукувати графік, вклеїти його в зошит, пояснити і зробити висновки.

8. ГПСП можуть іноді бути повністю невидимими, якщо нейрон перебуває в стані спокою. Завантажити й запустити файл Inter-3. Непомітно із запису потенціалу, але на початку розгортки в цьому експерименті є великий ГПСП. Графік провідності його фіксує, але в реальному експерименті немає змоги реєструвати провідність.

9. Знову змінити латентності так, щоб обидві події збігалися.

10. Роздрукувати графік, вклеїти і пояснити результати, зробити висновки.


Контрольні запитання

1. Які типи потенціал-чутливих каналів ви знаєте?

2. Які нейрони називають ендогенними?

3. Що відбувається в хімічному синапсі в разі синаптичної втоми